Eluição e Regeneração

Quando o meio cromatográfico estiver saturado, deve-se realizar a eluição. O princípio básico consiste em dessorver o produto alvo por meio de um íon ou grupo mais reativo. Diferentes sorventes apresentam diferentes níveis de reatividade. Portanto, um eluente adequado deve ser selecionado para eluir a proteína.  meios cromatográficos .

Existem basicamente três maneiras de eluir a cromatografia de troca iônica:
Uma das técnicas consiste na eluição simultânea. O eluente pode ser uma solução diluída de ácido, álcali ou sal, ou ainda um solvente orgânico apropriado, sendo a solução salina a mais utilizada. A forma farmacêutica é selecionada de acordo com a natureza do produto alvo e do produto final. Como a substância a ser absorvida geralmente não é uma única espécie, a carga de cada substância é diferente, assim como sua força de ligação ao meio. Mesmo utilizando o mesmo eluente, a substância mais facilmente substituível será a primeira a ser eluída, devido à sua forte força de ligação. Após a eluição, o material coletado por fracionamento permite a separação das diversas substâncias, obtendo-se um produto relativamente puro. Este método é frequentemente utilizado quando o comportamento do produto alvo é bem conhecido, ou para a separação de espécies analíticas.

O segundo método é a eluição gradual, ou seja, a eluição com diferentes concentrações de solução salina. Durante o processo de adsorção por troca iônica, uma variedade de proteínas é adsorvida. Se uma condição de eluição constante for utilizada, por vezes não é possível separar adequadamente todos os componentes, sendo necessário alterar as condições de eluição. Uma alternativa é a eluição gradual, na qual diferentes eluentes ou eluentes com diferentes valores de pH são utilizados em etapas, obtendo-se diferentes picos de eluição de acordo com as diferentes concentrações e acidez dos eluentes. Ou seja, uma determinada concentração de sal permite obter uma proteína específica, enquanto diferentes concentrações de sal permitem obter diferentes proteínas específicas. Este método de eluição gradual é adequado para a separação de proteínas de natureza conhecida, especialmente para produção em escala, sendo fácil de operar e controlar.

O terceiro tipo é a eluição em gradiente contínuo, ou seja, a alteração da força iônica ou do pH do eluato de acordo com uma determinada variação linear (geralmente apenas em casos especiais que utilizam um método de eluição que altera o pH). No processo de gradiente do eluato, diferentes proteínas são substituídas uma a uma para obter vários componentes proteicos e, ao mesmo tempo, as proteínas geralmente não apresentam cauda. A eluição em gradiente é o método de eluição mais comumente usado em cromatografia de troca iônica e também o método com maior capacidade de eluição, sendo adequado para a eluição de componentes semelhantes com propriedades de carga similares.

No processo de eluição, podem ser utilizadas tanto a eluição concorrente quanto a eluição contracorrente. A eluição concorrente, também chamada de eluição direta, ocorre quando o fluxo do eluente coincide com o fluxo do fluido de trabalho. Já a eluição contracorrente, também chamada de eluição reversa, ocorre quando o fluxo do eluente é oposto ao fluxo do fluido de trabalho. Se o líquido de alimentação for trocado e adsorvido de cima para baixo através da coluna de troca iônica, a concentração do adsorvato na camada superior da coluna será maior do que na camada inferior, e a dessorção reversa do eluato, de baixo para cima, poderá atingir o objetivo de eluição de forma mais eficiente. No entanto, como a operação de eluição reversa é muito mais complexa do que a eluição direta, ela geralmente se baseia na eluição positiva.

A vazão do eluente também afeta a separação na cromatografia de troca iônica, e geralmente a taxa de eluição é mantida constante. Em geral, a resolução com eluição lenta é melhor do que com eluição rápida, mas uma taxa de eluição muito lenta pode causar um tempo de separação prolongado, efeitos colaterais como difusão da amostra, alargamento do pico do espectro e redução da resolução. Portanto, a escolha da taxa de eluição adequada depende da situação específica. Se os picos de eluição estiverem relativamente concentrados em uma determinada área, causando sobreposição, a faixa do gradiente deve ser reduzida adequadamente ou a velocidade de eluição deve ser diminuída para aumentar a resolução. Se a resolução for boa, mas o pico de eluição for muito amplo, a taxa de eluição deve ser aumentada adequadamente.