Ni Seplife ®Meio Cromatográfico de Afinidade 6FF (IDA)

Resina de cromatografia de agarose quelante de níquel

Instruções Ni Seplife 6FF (IDA)

Ni Seplife ® Perfil do produto de mídia cromatográfica de afinidade 6FF (IDA):

Cromatografia de Agarose Quelante de Ni  (IDA) liga-se ao ácido iminodiacético em meio de agarose 6FF e depois quela o íon de Ni2+ para ser um  meio cromatográfico de afinidade . É amplamente utilizado para  processamento de proteínas ,  ácido nucleico  e  purificação de polipeptídeo  no fluxo descendente de  biofarmacêutica e bioengenharia .

Ni Seplife ® Parâmetros de resina de meio cromatográfico de afinidade 6FF (IDA):

Ni Seplife ® Instrução de teste de meio cromatográfico de afinidade 6FF (IDA):

1. Embalagem de coluna
(1) Todo o material e reagente em temperatura ambiente, preparando o tampão inicial e o beffer de eluição.
(2) Pegue uma amostra de resina de acordo com o tamanho da coluna, lave 20% de etanol para secar, use tampão (a proporção de resina: tampão = 3:1) para homogenizar e desgaseificar o tratamento.
(3) Use água ou tampão para manter o interior ou o fundo da coluna úmido, o nível de água ou tampão deve ser superior ao da membrana do filtro e certifique-se de que o fundo da coluna não tenha bolhas.
(4) Use uma haste de vidro para guiar o homogeneizado na coluna junto com a face interna da coluna uma vez para evitar qualquer bolha. Abra a válvula de saída da coluna para fazer a resina assentar livremente e conecte bem a tampa superior da coluna.
(5) Abra a bomba peristáltica, use o tampão para passar pela coluna a uma vazão de 1,33 vezes maior que a vazão do tampão normal usando. Use buffer 2-3BV para equilibrar a coluna.
2.Equilíbrio
Equilibre com 2 a 5 volumes de leito de solução tampão inicial até que a condutividade, o pH e outros parâmetros permaneçam inalterados.
3. Carregamento de amostra
(1) A amostra é geralmente dissolvida no tampão inicial de pH 6-8, e aumentar o pH do tampão de carga pode aumentar a carga.
(2) O tampão não deve conter EDTA e citrato, e é melhor evitar agentes redutores como mercaptoetanol e DTT.
(3) A solução tampão comumente usada tem solução tampão de fosfato de sódio de 10 a 100 mmol / L, solução tampão de 20 a 200 mmol / LTris-HCl.
(4) 0,15 a 0,5 mol/L de NaCl são geralmente adicionados ao tampão para eliminar a troca iônica.
(5) Ao usar um gel de agarose quelato de níquel pela primeira vez, recomenda-se usar 50 mmol/L de PBS (50 mmol/L de NaH2PO4, 0,5 mol/L de NaCl, pH 7,4) como tampão inicial.
4.Eluição
A eluição é geralmente dividida nos seguintes métodos:
(1) Reduzir a eluição do pH: A maioria das proteínas será eluída em pH 6-4 (também em pH 3-4), e o tampão pode ser acetato de sódio, ácido cítrico e sistemas tampão de fosfato.
(2)Eluição competitiva: aumentar ou aumentar linearmente a concentração de substâncias concorrentes com afinidade por íons metálicos (por exemplo, 0-0,5 mol/L de imidazol, 0-50 mmol/L de histidina, 0-2 mol/L de NH4Cl).
(3) Eluição do agente quelante: agentes quelantes como EDTA e EGTA podem reagir com íons metálicos para causar a eluição da proteína. No entanto, este método não pode separar proteínas diferentes e afeta a adsorção de proteínas, resultando na incapacidade de suspensão da proteína de fusão.

Ni Seplife ® Observações sobre mídia cromatográfica de afinidade 6FF (IDA):

(1) Ao usar pela primeira vez, se a concentração de imidazol necessária para a eluição for incerta, recomenda-se adicionar 10mmol/L, 20mmol/L, 50mmol/L, 100mmol/L, 200mmol/L, 500mmol/L para o buffer inicial. O imidazol foi eluído e coletado de baixo para alto, respectivamente, e os resultados eluídos foram identificados por eletroforese SDS-PAGE.
(2) O imidazol é alcalino e o pH é ajustado com HCl após a preparação do tampão correspondente.
(3) Diminuir a eluição do pH e eluir o agente quelante fará com que os íons metálicos caiam, e os íons metálicos precisam ser re-quelados antes do próximo uso.
(4)Condicionalmente, uma eluição linear com gradiente de imidazol pode ser realizada para determinar as condições de eluição preferidas.
Para os métodos de eluição acima, 150 a 500 mmol/L de NaCl devem ser adicionados ao tampão para eliminar a troca iônica.
5.Regeneração
(1) O gel deve ser decapado e regenerado após uso repetido ou quando for necessário substituir os íons metálicos quelados. Método de remoção de níquel: primeiro enxágue a coluna com 5 a 10 volumes de leito de água destilada, depois enxágue a coluna com 5 a 10 volumes de leito de EDTA 100 mmol/L e, finalmente, use 2 a 3 volumes de leito de lavagens de NaCl 0,5 mol/L eliminar o EDTA residual.
(2) A coluna usada várias vezes geralmente precisa ser limpa após a remoção do níquel. Método de limpeza: Inverta a coluna com 0,1 ~ 1,0 mol / L de NaOH, mantenha-a a 50 cm / h por 1 ~ 2 h, não só pode remover as impurezas fortes, mas também remover a fonte de calor.
(3)Requelação de íons metálicos após a limpeza. Método de quelação: primeiro, a coluna após a remoção do níquel é totalmente equilibrada com 2 a 5 volumes de leito de água destilada e, em seguida, 0,1 a 0,3 mol/L de solução de sal metálico é usada para passar 5 a 10 volumes de leito para quelar íons metálicos. Enxágue com 5 a 10 volumes de água destilada para remover íons metálicos não quelados.
6.CIP
(1) Remoção de proteínas adsorvidas por troca iônica: 2 a 3 volumes de leito foram lavados com solução de NaCl 2 mol/L.
(2) Remoção de proteínas e lipídios hidrofóbicos fortes, etc.: 4 volumes de leito foram lavados com etanol a 70% ou isopropanol a 30%.
(3)Remoção de proteína precipitada, proteína hidrofóbica: etapa de regeneração de gel de referência.
7.Armazenamento
Selado e armazenado a 4~30°C (20% de etanol em solução de armazenamento), seco, ventilado, limpo, não congelado; as colunas usadas são armazenadas em solução de etanol a 4~8°C e 20%.

Cuidado:
(1)A amostra e Ni seplife ®6FF (IDA) deve ser equilibrado com o tampão de eluição e depois ir para a coluna de cromatografia.
(2) O leito da coluna deve ser plano, livre de ranhuras e bolhas de ar, caso contrário deverá ser reinstalado.
(3) Ao utilizar, certifique-se de que a temperatura da coluna e do tampão sejam iguais, evitando a geração de bolhas no leito da coluna e afetando o efeito de purificação.
(4) A vazão deve ser rigorosamente controlada durante o processo de eluição e não muito rápida.
(5) Durante o carregamento e todo o processo de eluição, a superfície do cilindro é impedida de secar.